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離子對(duì)色譜由Gordon Schill博士于1973年建立，其方法是將離子性化合物添加到流動(dòng)相中以促使離子與帶電荷分析物形成配對(duì)離子。這些試劑由帶有可離子化終端的烷基鏈組成。當(dāng)在反相條件下用于常見的憎水性HPLC固定相時(shí)，離子對(duì)試劑可選擇性的增加帶電荷分析物的保留時(shí)間。

離子對(duì)試劑的選用步驟
1. 選擇一根適合的色譜柱，常為C18柱；
2.準(zhǔn)備流動(dòng)相時(shí)僅使用HPLC級(jí)別的水和色譜級(jí)試劑；
3.選擇能給出最佳分離度的流動(dòng)相成分和濃度；
4.如果樣品中有非離子化物質(zhì)，在嘗試離子化分離之前首先優(yōu)化分離情況；
5.選擇合適的離子對(duì)系列試劑以提供相應(yīng)的離子配對(duì)：對(duì)于酸性分析物使用酸性離子對(duì)試劑；對(duì)于堿性分析物使用堿性離子對(duì)試劑；
用于酸性化合物：四丁基氫氧化銨（10%水溶液） 、四丁基溴化銨、十二烷基三甲基氯化銨
用于堿性化合物：戊烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉 、庚烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉、癸烷磺酸鈉
6.通過比較選擇所得分離度最好的離子對(duì)試劑；
7.一旦離子對(duì)試劑已經(jīng)確定，調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值將分離度最大化；因?yàn)槲⑿〉膒H值改變對(duì)保留性質(zhì)和選擇性都有較大的影響，所以仔細(xì)小心的小幅度調(diào)節(jié)pH值；
8.理想狀況下，流動(dòng)相中的離子對(duì)試劑濃度應(yīng)為0.005M，但是稍微增加離子對(duì)試劑可能會(huì)稍微增加保留性質(zhì)并因此優(yōu)化分離情況。

離子對(duì)色譜法中的變量影響

離子對(duì)色譜法相比于普通反相色譜法，可以通過調(diào)節(jié)參數(shù)（包括pH、離子對(duì)試劑的類型和濃度、溫度等）來滿足分離度等要求。

1. 流動(dòng)相的pH：在離子對(duì)方法中pH不僅影響分析物的離子化程度，也影響加入的離子對(duì)試劑的離子化進(jìn)度而影響與分析物的離子對(duì)作用，因此pH的改變對(duì)分析物保留的影響更加復(fù)雜。

2. 溫度：離子對(duì)方法中溫度的改變會(huì)引起相對(duì)保留值發(fā)生顯著性的變化。溫度會(huì)改變色譜柱上吸附的離子對(duì)試劑的量，因此控制溫度對(duì)分離特別重要。

3. 離子對(duì)試劑的類型和濃度：大多數(shù)情況下，固定相中離子對(duì)試劑的濃度會(huì)影響溶質(zhì)的離子交換的保留行為，而離子對(duì)試劑的類型和濃度會(huì)直接影響其在固定相中的濃度。

*當(dāng)想要獲得一定的保留時(shí)，可以使用更低濃度的，疏水性更強(qiáng)的離子對(duì)試劑或者更高濃度的，疏水性更弱的離子對(duì)試劑。

*當(dāng)固定相中的離子對(duì)試劑達(dá)到飽和時(shí)，繼續(xù)增加離子對(duì)試劑的濃度反而會(huì)降低分析物的保留，因?yàn)殡x子對(duì)試劑的反離子濃度增加，加大與分析物的離子交換競爭。

*流動(dòng)相的pH和離子對(duì)試劑的濃度的同時(shí)改變，則可以在很大程度上控制離子樣品的保留范圍和相對(duì)保留值。

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